Twintig jaar na de eerste actiegame keren Mario en Luigi terug naar hun originele stijl van doen. De klassieke platformformule is toen uitgevonden en dankzij dit spel weer klaar voor een nieuwe generatie spelers. De boosaardige koning der Koopa's Bowser heeft prinses Peach gekidnapt en het is aan Mario en Luigi om haar uit zijn grijpgrage klauwen te redden.

Dit avontuur kunnen spelers alleen beleven, maar op elk moment kunnen anderen meehelpen. Uiteindelijk kan er met vier spelers tegelijk gesprongen worden in de diverse platformlevels. Spelers moeten niet alleen samenwerken om schildpadden en ander gespuis te verslaan, maar elkaar ook te snel af zijn om uiteindelijk de winnaar van het level te worden. Zo kunnen spelers elkaar het ene moment helpen bij het verslaan van een lastige vijand, om elkaar het volgende moment de afgrond in te duwen en er met de munten vandoor te gaan.

Om de vijanden te verslaan, kan elk personage voorwerpen verzamelen om speciale krachten te krijgen. Bekende voorwerpen als paddenstoelen en vuurbloemen zijn aanwezig, maar er zijn ook enkele nieuwe voorwerpen, zoals het propellorpak waarmee jij én een tweede speler de lucht in kunnen vliegen en het pinguïnpak waarmee sneeuwballen gegooid kunnen worden.