Het tweede deel in de Assassin's Creed-trilogie speelt zich af in Italië ten tijde van de Renaissance, in de vijftiende eeuw. Hoofdrolspeler is Ezio Auditore di Firenze, een jongeman van goede komaf. Zijn familie is vermoord en Ezio besluit zichzelf van edelman om te scholen tot sluipmoordenaar, zodat hij zijn familie kan wreken. Dit betekent dat Ezio het opneemt tegen leden van de machtige families van Italië, die hun leven dus niet langer zeker zijn.

Net als het eerste deel speelt Assassin's Creed II zich af in een grote, open wereld, waarin de speler de keuze krijgt om missies aan te nemen. Hierdoor kun je Italiaanse steden als het Florence en Venetië van de vijftiende eeuw vrijelijk verkennen. De keuzes die je maakt hebben invloed op de verloop van het verhaal, waardoor de speler meerdere verhaallijnen kan meemaken.

Als sluipmoordenaar kan Ezio gebouwen beklimmen om zich via de daken te verplaatsen, maar hij zich ook mengen tussen het volk om op de drukbevolkte straten in de massa op te gaan. Er is veel onderzoek gedaan naar het verleden van de Italiaanse steden, om de sfeer van de Italiaanse Renaissance zo goed mogelijk over te kunnen brengen.

Tijdens zijn reis komt Ezio onder andere Leonardo da Vinci tegen, die zich opwerpt als de mentor van de jonge sluipmoordenaar. Leonardo voorziet Ezio van diverse handige uitvindingen, waardoor Ezio meer mogelijkheden heeft dan in het eerste deel om zijn vijanden om te leggen. Naast nieuwe wapens krijgt Ezio ook een vliegmachine van Leonardo, waardoor het luchtruim nu ook gebruikt kan worden om moeilijk indringbare plekken te infiltreren. Ook kan Ezio zwemmen, waardoor de speler meer dan ooit alle aspecten van de omgeving kan gebruiken om zijn missies als sluipmoordenaar met succes te voltooien.